Станом на сьогодні у нас: 141825 рефератів та курсових робіт
Правила Тор 100 Придбати абонемент Технічна підтримка
Скористайтеся пошуком, наприклад Реферат        Грубий пошук Точний пошук
Вхід в абонемент



КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Філіппов Ігор Борисович

УДК 577.612.815:612.73

Метаботропна регуляція синаптичного пуринергічного гальмування в вісцеральних гладеньких м’язах

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка на кафедрі біофізики біологічного факультету

Науковий керівник:

академік НАН України, доктор медичних наук, професор Шуба Михайло Федорович

доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, декан біологічного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Лях Юрій Єремійович

Донецький національний медичний університет ім. М. Горького, завідувач кафедри медичної біофізики, медапаратури та клінічної інформатики

кандидат біологічних наук, доцент

Манько Володимир Васильович

Львівський національний університет імені Івана Франка, доцент кафедри фізіології людини і тварин

Захист відбудеться 20 лютого 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 16 січня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останнє десятиріччя фізіологія, біофізика та фармакологія гладеньких м’язів травного тракту приділяє значну увагу дослідженню активації специфічних G-білків, спряжених з внутрішньоклітинними ферментами або іонними каналами. Вважається, що гальмівна дія аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ), вивільненої із нервових терміналей, на гладенькі м’язи шлунково-кишкового тракту опосередкована через метаботропні Р2У- пуринорецептори [Marhy and Makhlouf, 1998; Kong et al., 2000]. На превеликий жаль, на сьогодні немає достатньо селективних фармакологічних засобів, які б з високою вибірковістю активували або пригнічували метаботропні Р2У-пуринорецептори, що не дозволяє остаточно визначити їх функціональну роль.

Активація Р2У-пуринорецепторів через Gq/11-білки та фосфоліпазу С [Marhy and Makhlouf, 1998; Communi et al., 2001] призводить до утворення інозитол-1,4,5-трифосфату (ІР3) і, як наслідок його дії, вивільнення іонів кальцію із внутрішньоклітинного кальцієвого депо з наступною активацією процесів за участі цього вторинного посередника. Відомо також, що передача сигналів від Р2У11-пуринорецепторів здійснюється із залученням різних G-білків (Gq/11 і Gs) і спряжена з подальшою активацією як аденілатциклазного, так і Са2+-поліфосфоінозитольного регуляторних каскадів [Ralevic and Burnstock, 1998; Kegelgen and Wetter, 2000; Abbracchio et al., 2006]. У зв’язку з вище наведеним, метаболічна регуляція клітинних процесів стає головною у дослідженні пуринергічної синаптичної передачі в інтестинальних гладеньких м’язах.

У гладеньких м’язах шлунково-кишкового тракту, згідно даних літератури, Р2У гальмівні пуринорецептори пов’язані, з тим же типом G білків (а можливо й однаковою системою внутрішньоклітинних посередників), що і збуджувальні мускаринові холінорецептори (М3) [Unno, 2003]. Можна припустити, що цілеспрямоване виділення Са2+ із саркоплазматичного ретикулума повинне мати першорядне значення для того, щоб при активації М-холінорецепторів виникало збудження і скорочення, а при активації Р2У-рецепторів – гальмування і розслаблення. Тому, можна очікувати, що при сумісній або селективній активації певного типу мускаринових холіно- і пуринорецепторів повинні бути відмінності в процесах регуляції клітинних механізмів функціонування гладеньких м’язів.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Робота виконана в рамках науково-дослідних робіт кафедри біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (тема №01БФ036-02 "Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів у збудливих біологічних системах") та гранту INTAS №01-0093 "Мембранні та внутрішньоклітинні механізми пуринергічного гальмування гладеньких м’язів шлунково-кишкового тракту".

Мета роботи полягала у з’ясуванні клітинних механізмів регуляції синаптичного пуринергічного гальмування у вісцеральних гладеньких м’язах при активації метаботропних рецепторів.

Для досягнення даної мети слід було вирішити наступні завдання:

Дослідити участь фосфоліпази С у генерації неадренергічного синаптичного гальмування в гладеньких м’язах.

Визначити роль тирозинкінази в процесах генерації синаптичного гальмування.

Визначити участь внутрішньоклітинних кальцієвих депо ГМК в пуринергічному синаптичному гальмуванні.

Дослідити можливу участь аденілатциклази в модуляції пуринергічного гальмування.

Дослідити особливості клітинних механізмів передачі сигналу при одночасній активації збуджувальних мускаринових холінорецепторів і гальмівних пуринорецепторів мембрани ГМК.

Об'єкт дослідження: поздовжні та кільцеві м’язи товстого кишечнику, а також гладенькі м’язи фундального відділу шлунка.

Предмет дослідження: метаботропна регуляція пуринергічного гальмування гладеньких м’язів.

Методи дослідження: модифікований сахарозний місток і тензометричний метод реєстрації скорочення.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше виявлена участь залежних від фосфоліпаза С компонентів неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів. Показано, що вивільнення іонів кальцію із інозитолтрифосфатчутливого та ріанодинчутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо пов’язане із генерацією швидкого і повільного компонентів неадренергічних гальмівних потенціалів, відповідно. Знайдено різницю між клітинними механізмами гальмування, викликаного дією АТФ, за умов селективної активації М3- або М2-холінорецепторів та сумісної синергічної активації холінорецепторів обох вказаних підтипів.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі дані значно поглиблюють та розширюють уявлення про механізми регуляції синаптичного неадренергічного пуринергічного гальмування в інтестинальних гладеньких м’язах. Результати роботи можуть бути застосовані для розробки фармакологічних засобів корекції патологічних станів, пов’язаних з гіперактивністю гальмівної синаптичної передачі в гладеньких м’язах шлунково-кишкового тракту.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем було самостійно виконано аналіз наукової літератури, проведені експериментальні дослідження та обробка отриманих результатів, їх викладення та порівняння з даними інших авторів. Розробку концепції роботи, планування експериментів, обговорення та формування висновків було проведено за участі наукового керівника та співавторів робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на ІІ конференції Українського товариства нейронаук (30 травня – 3 червня, Донецьк, 2001р.), Second Bogomoletz-Nencki Symposium "Intracellular Signaling in Excitable Cells" (Kiev, Ukraine, September 1 - 2, 2002), 2nd Kiev Symposium "Smooth Muscle Physiology and Biophysics” (Kiev, Ukraine, 28 - 31 October), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 25 - 28 квітня, 2004 р.), Europen congress on pharmacologu (Porto, Portugal, 14 - 17 Joly, 2004), III конференции украинского общества нейронаук с международным участием, посвященной 75-летию Донецкого государственного медицинского университета им. М. Горького (23 - 27 мая, 2005 г.), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, 18 - 20 травня 2006 р).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в трьох статтях і шести тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків і списку використаних джерел із 233 посиланнями. Робота викладена на 129 сторінках та ілюстрована 3 таблицями і 31 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень

У дослідах використовувались морські свинки невеликих розмірів (вагою 250 - 300 г) незалежно від статі. Тварин наркотизували медичним ефіром, декапітували та проводили розтинання черева. Об’єктом дослідження були поздовжні (taenia coli) та кільцеві (cacum) м’язи сліпої кишки, кільцеві м’язи дистального відділу товстого кишечнику (colon), а також гладенькі м’язи фундального відділу шлунка. Після очищення від слизового й підслизового шару видалені ділянки шлунка і кишечнику, під бінокуляром у розчинні Кребса, нарізали на м’язові смужки поздовжнього та кільцевого шарів довжиною 0,7 – 1,2 см, шириною 0,2 – 0,3 см. Далі м’язові смужки закріпляли шовковою лігатурою з обох кінців та поміщали у свіжий розчин Кребса, де вони витримувалися до початку експерименту протягом 2 годин.

Як основний метод досліджень використовували модифіковану методику одинарного сахарозного містка [Артьоменко и др., 1982], яка дозволяє одночасно відводити електричну та реєструвати скоротливу активність гладеньких м’язів і адекватно подразнювати м’язові смужки. Перевагою цього методу, у порівнянні з методом подвійних сахарозних містків, є можливість реєстрації синаптичних потенціалів у відповідь на подразнення інтрамуральної нервової системи інтестинальних гладеньких м’язів електричним струмом. Подразнення гладеньком’язових клітин і відведення електричних потенціалів здійснювали за допомогою хлор-срібних електродів, які з’єднувалися з розчинами через агарові містки, заповненні 2,5 мМоль/л КСl. Один з подразнюючих електродів розміщували в тест-ділянці, а другий електрод з’єднували з розчином Кребса, що заповнює поліетиленову трубку. З метою зменшення шунтуючої дії зазору між м’язовою смужкою і поліетиленовою трубкою, устя трубки змазували вакуумною змазкою. Синаптичні потенціали в гладеньких м’язах морської свинки викликали подразненням інтрамуральних нервових утворень, які знаходяться в товщі м’язових смужок прямокутними імпульсами електричного струму вхідного або вихідного напрямків тривалістю 0,5 – 1 мс. Джерелом струму служив стимулятор ЕСУ-1. Для відведення електричних потенціалів від гладеньком’язових клітин один із електродів поміщали в ділянку камери, яка була заповнена ізотонічним розчином КСl, а інший - у тест-ділянку. Електричну активність, що відводилась, подавали на вхід катодного повторювача, який з’єднувався із автоматичним потенціометром КСП-4. Реєстрацію скоротливої активності м’язових смужок проводили в ізометричному режимі за допомогою ємнісного датчика сили. Електричні сигнали від якого передавалися на другий канал КСП-4. Запис електричних та скоротливих реакцій проводили на діаграмній стрічці КСП-4. У тестуючій ділянці камери м’язова смужка обмивалася проточним розчином Кребса (рН якого знаходився в межах 7,2 - 7,3), температура підтримувалася на рівні 36,5 0,5 С.

Для дослідження взаємодії збуджувальних та гальмівних впливів при одночасній активації холінорецепторів, з одного боку, і гальмівних пуринорецепторів – з іншого, використовували м’язові смужки подовжніх м’язів сліпої кишки морської свинки в умовах тензометричної реєстрації скорочення. Скорочення м’язових смужок викликали аплікацією 10 мкМоль/л карбахоліну протягом 10 хв, у ході тонічного компонента цього скорочення (приблизно на 5-й хвилині) в оточуючий розчин Кребса, додавали 1 мМоль/л АТФ, дія якої продовжувалася 2 хв. Потім препарати протягом 3 хв відмивали розчином Кребса без АТФ, але як і раніше він містив карбахолін. Ефекти перших двох аплікацій до уваги не брали. Інтервал між послідовними аплікаціями карбахоліну складав не менше 30 - 40 хв.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Участь фосфоліпази С у генерації неадренергічного синаптичного

гальмування гладеньких м’язів кишечнику

Відомо, що мембранні та внутрішньоклітинні процеси відіграють важливу роль у регуляції скоротливої активності вісцеральних гладеньких м’язів. ATP вважається нейромедіатором, гальмуюча дія якої на гладенькі м’язи кишечника опосередкована через метаботропні пуринорецептори. Ці рецептори спряжені через Gq/11-білок з фосфоліпазою С-. Для дослідження ролі внутрішньоклітинних посередників і функції фосфоліпази C у механізмах генерації гальмівних синаптичних потенціалів, ми використовували U73122 - як більш специфічний інгібітор цього ферменту. Показано, що U73122 в концентрації 10 мкMоль/л зменшував амплітуду гальмівних синаптичних потенціалів, викликаних поодиноким електричним подразненням, і АТФ-індуковану гіперполяризацію мембран гладенько-м’язових клітин (ГМК), викликану в усіх досліджуваних гладеньком’язових смужках незалежно від відділу кишечнику (рис.1). U 73122 не мав значного впливу на мембранний потенціал гладеньком’язових клітин. Більш ефективно блокатор фосфоліпази С пригнічував гальмівні синаптичні потенціали (ГСП) подовжніх та кільцевих гладеньких м’язів сліпої кишки (табл. 1).

Рис. 1. | Вплив блокатора фосфоліпази С U73122 (10 мкМоль/л) на генерацію гальмівних синаптичних потенціалів і екзогенну дію АТФ (1 мМмоль/л) у кільцевих гладеньких м'язах товстої кишки

А - безперервний запис синаптичних потенціалів (а) і скорочення (б); Б – ГПС у контролі (1) та зменшення його амплітуди на 30 хв дії U73122 (2); В - екзогенна дія АТФ у контролі (1) та на 30 хв дії U73122 (2) |

Таблиця 1

Вплив інгібітору фосфоліпази С U73122 на амплітуду гальмівних синаптичних потенціалів, викликаних поодиноким електричним подразненням і АТФ-індуковану гіперполяризації мембрани ГМК м'язових препаратів кишечнику морської свинки

Умови експерименту | Амплітуда ГСП, мВ (М±m, n=9) | Амплітуда АТФ-викликаної

гіперполяризації, мВ

(M±m, n=5) | Подовжні гладенькі м’язи сліпої кишки | контроль | 14,9 ± 2,5 мВ | 7,2 ± 3,1 мВ | 30 хв дії U 73122

(10 мкМоль/л) | 6,1 ± 2,8 мВ | 3,0 ± 1,9 мВ | пригнічення , % | 60,4 ± 8,7 | 61,3 ± 7,9 | Кільцеві гладенькі м’язи сліпої кишки | контроль | 12,8 ±3,2 мВ | 9,5 ± 3,2 мВ | 30 хв дії U 73122

(10 мкМоль/л) | 6,0 ± 2,2 мВ | 3,7 ± 2,1 мВ | пригнічення, % | 53,2 ± 4,9 | 63,4 ± 7,6 | Кільцеві гладенькі м’язи товстого кишечнику | контроль | 13,1 ± 2,6 мВ | 4,5 ± 1,6 мВ | 30 хв дії U 73122

(10 мкМоль/л) | 8,1 ± 2,7 мВ | 1,9 ± 0,7 мВ | пригнічення , % | 38,5 ± 5,1 | 42,1 ± 0,4 | U 73122 не впливав на амплітуду збуджуючих синаптичних потенціалів (ЗСП), викликаних на фоні дії апаміну. Останнє дозволило нам зробити висновок, що функціонування фосфоліпази С необхідне, головним чином, для генерації пуринергічного синаптичного гальмування, а не збудження.

Враховуючи те, що майже в усіх ділянках шлунково-кишкового тракту в складі пуринергічного гальмування завжди є NO-залежний компонент [Dalziel et al., 1991; Bennett, 1997], то було важливо з’ясувати вплив на нього блокатора фосфоліпази С. У присутності апаміну м’язові смужки товстої кишки морської свинки генерують ГСП повільної кінетики NO-ергічної природи [Владимирова и Шуба, 1978; Владимирова и др, 1993]. Наступне додавання до розчину Кребса з апаміном U73122 істотно не впливало на амплітуду і кінетику NO-ергічного гальмівного синаптичного потенціалу. Більше того, спонтанні коливання мембранного потенціалу ГМК, що виникали після ГСП, також не зазнавали суттєвих змін. Усе це вказує на присутність незалежного від фосфоліпази C NO-активованого гальмування в інтестинальних ГМК. Необхідно зазначити, що пригнічуюча дія блокатора фосфоліпази С не залежить від наявності чи відсутності атропіну в розчині Кребса. Ці дані свідчать про те, що активація мускаринових рецепторів ендогенним нейропередавачем при інтрамуральному подразненні не впливає на залежні від фосфоліпази С шляхи пуринергічного гальмування.

Участь тирозинкінази в процесах генерації нехолінергічних

неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів

Генерації ГСП за участі незалежного від фосфоліпази C шляху може мати інший механізм трансдукції, наприклад залучення тирозинкінази. Активація фосфоліпази C-iзоформи пов’язана зі стимуляцією G-білка зв’язаного з рецептором, тоді як, активація фосфоліпази C-ізоформи активується прямим фосфорилювання тирозину каталітичного домену. З активацією тирозинкінази пов'язано підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ або внаслідок прямого фосфорилювання тирозину ІР3-рецепторів саркоплазматичного ретикулума, або активації специфічної фосфоліпази C-ізоформи, яка, у свою чергу, буде ініціювати утворення ІР3 і діацилгліцеролу [Mikoshiba, 1997]. Неможна виключити і прямого фосфорилювання тирозинкіназою іонних каналів плазматичної мембрани ГМК, яке спричиняє модифікацію роботи каналів [Smirnov and Aaronson, 1995; Li et al., 2006].

У наших експериментах використовувався інгібітор тирозинкінази геністеїн [Akiyuma, et al., 1987] у концентрації 10 мкМоль/л. Він зменшував амплітуду ГСП, викликаних поодиноким інтрамуральним подразненням, у м’язових препаратах сліпої та товстої кишки. ATФ-викликана гіперполяризація в гладеньких м’язах також значно пригнічувалась геністеїном. Він, як і U 73122, більш ефективно пригнічував ГСП та АТФ-викликану гіперполяризацію мембрани ГМК у кільцевих препаратах гладеньких м’язів сліпої кишки ніж у кільцевих препаратах дистального відділу товстого кишечнику.

Ці дані показують, що в генерацію неадренергічних синаптичних потенціалів гладеньких м’язів кишечнику може залучатися тирозинкіназа. На відміну від блокатора фосфоліпази С, геністеїн поряд з пригніченням амплітуди, також значно зменшує і тривалість ГСП (табл. 2). Останнє вказує на здатність тирозинкінази впливати не тільки на генерацію "швидкого", але й "повільного" компонента неадренергічного гальмівного синаптичного потенціалу.

Таблиця 2

Вплив блокатора тирозинкінази геністеїну на гальмівні синаптичні потенціали, викликані поодиноким електричним подразненням і АТФ-викликану гіперполяризацію мембрани гладеньком’язових клітин кишечника морської свинки

Умови експерименту | Параметри ГСП | Амплітуда АТФ-викликаної

гіперполяризації, мВ

(M±m, n=5) | амплітуда, мВ

(M±m, n=9) | тривалість, с

(M±m, n=9) | Кільцеві препарати гладеньких м’язів сліпої кишки | контроль | 11,7 ±2,6 | 2,0 0,5 | 9,2 ± 2,3 | 30 хв дії геністеїну

(10 мкМоль/л) | 6,7 ± 1,7 | 1,2 0,3 | 3,9 ± 1,8 | пригнічення, % | 48,1 ± 7,1 | 40,0 4,5 | 60,1 ± 9,7 | Кільцеві препарати гладеньких м’язів товстого кишечника | контроль | 13,3 ± 3,0 | 4,18 ± 0,1 | 6,2 ± 1,9 | 30 хв дії геністеїну

(10 мкМоль/л) | 8,7 ± 2,2 | 2,0 0,1 | 1,9 ± 0,6 | пригнічення, % | 35,1 ± 2,1 | 52,2 3,1 | 67,3 ± 2,5 |

Здатність геністеїну пригнічувати ГСП навряд чи можна пов’язати із блокуванням синтезу або вивільненням нейромедіаторів гальмування з нервових терміналей, а також з утворенням ІР3 чи фосфорилюванням його рецепторів у саркоплазматичному ретикулумі ГМК. Також, не можна виключити того, що в блокуванні геністеїном АТФ-викликаної гіперполяризації і неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів залучені різні механізми. Скоріше за все дія геністеїну на генерацію ГСП обумовлена безпосереднім впливом на калієві канали плазматичної мембрани ГМК [Smirnov et al., 1995; Shi-Ying Li et al., 2006].

Дослідження дії блокаторів інозитолтрифосфатних та ріанодинових рецепторів на пуринергічне гальмування в гладеньких м’язах кишечника

Оскільки активація різних ізоформ фосфоліпази C супроводжується збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР3, то було важливим дослідити дію блокатора ІР3-рецепторів на неадренергічні гальмівні синаптичні потенціали та ATФ-викликану гіперполяризацію плазматичної мембрани ГМК. Для цього використовували мембраннопрониклу форму блокатора ІР3-рецепторів - 2-аміноетоксідифенілборат (2-APB) [Maruyma et al., 1997]. Результати експериментів показали, що 2-APB у межах концентрацій 50 -100 мкМоль/л, майже повністю пригнічує ГСП і ATФ-викликану гіперполяризацію в атропінізованих гладеньком’язових препаратах сліпої та товстої кишки (рис.2). Імовірно, що локальне вивільнення іонів Ca2+ із ІР3-чутливого внутрішньоклітинного депо може бути сполучною ланкою між P2Y- пуринорецепторами й активацією кальційзалежних калієвих каналів малої провідності. Треба зауважити, що в присутності 2-APB не генерується збудження на інтрамуральне подразнення або на екзогенну дію ATФ, подібне до того, що спостерігається в присутності апаміну.

Рис. 2. | Дія блокатора ІР3-рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) на гальмівний синаптичний потенціал (А) і гіперполяризацію мембрани ГМК викликану 1 мМоль/л АТФ (Б) в кільцевих м'язових препаратах сліпої кишки морської свинки.

1 - контроль; 2 - 20-та хв аплікації 2-АРВ; а і b електричні та механічні записи, відповідно.

Можна припустити, що блокування вивільнення іонів Ca2+ з ІР3-чутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо, яке обумовлене дією 2-APB, впливатиме на мобілізацію цього катіону з ріанодин(кофеїн)-чутливої частини саркоплазматичного ретикулума ГМК. Відповідні експерименти показали, що аплікація ріанодину (10 мкMоль/л) не призводить до помітних змін пуринергічних гальмівних синаптичних потенціалів у м’язових препаратах сліпої кишки. У кільцевих гладеньких м’язах товстої кишки ріанодин зменшував тільки повільний NO-ергічний компонент ГСП.

Дослідження впливу збільшення рівня внутрішньоклітинної концентрації

іонів кальцію в гладеньком’язових клітинах на генерацію гальмівних синаптичних потенціалів

Для дослідження ролі внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ в генерації ГСП, яка не пов’язана з мобілізацією із внутрішньоклітинного кальцієвого депо, ми використали активатор кальцієвих каналів - Вау K 8644. Дія Вау K 8644 у концентрації 0,1 мкMоль/л призводила до деполяризації мембрани ГМК, активації спонтанної електричної та скоротливої активності й до зменшення амплітуди ГСП та ATФ-індукованої (1мМоль/л) гіперполяризації мембрани ГМК. Усі ці зміни в ГМК було відновлено після блокування потенціалзалежних кальцієвих каналів L-типу ніфедипіном у концентрації 10 мкMоль/л. Додавання ніфедипіну до розчину Кребса з Вау K 8644 супроводжувалося реполяризацією мембрани ГМК, відновленням амплітуди ГСП і ATФ-індукованої гіперполяризації мембрани ГМК. У наших експериментах було встановлено, що блокуюча дія Вау K 8644 на ATФ- і NO-ергічне гальмування не залежить від природи нейромедіаторів, які приймають участь у генерації ГСП.

Таким чином, отримані результати показали, що активація метаботропних Р2У- пуринорецепторів плазматичної мембрани ГМК АТФ, яка опосередкована через G-білки і систему внутрішньоклітинних посередників, викликає вивільнення іонів Са2+ із ІР3-чутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо. І тільки, власно, вивільнення іонів Са2+ із цього депо цілеспрямовано активує кальційзалежні калієві канали малої провідності, які приймають участь у генерації швидкого (пуринергічного) компонента ГСП. Збільшення концентрації внутрішньоклітинного Са2+ вище фізіологічного рівня, ймовірно, може викликати інактивацію кальційчутливих білків, які беруть участь у синаптичній передачі.

Дослідження можливої модуляції аденілатциклазою

пуринергічного гальмування гладеньких м’язів

Відомо, що в багатьох процесах регуляції функціонування нервових і м'язових клітин беруть участь цАМФ-залежні внутрішньоклітинні механізми. Показано, наприклад, що клоновані Р2У11-рецептори за допомогою різних G-білків (Gq/11 і Gs) бінарно сполучені з фосфоліпазою С і аденілатциклазою [Boeynaems et al., 2000]. Приймаючи до уваги складну медіаторну природу неадренергічних ГСП, можна припустити, що не залежний від фосфоліпази C його компонент, обумовлений цАМФ-залежними внутрішньоклітинними механізмами. Крім того, АТФ, вивільнена із нервових закінчень, може частково розщеплюватися до аденозину, який, взаємодіючи з аденозиновими рецепторами, активуватиме аденілатциклазу. Тому метою даної частини роботи було дослідити значення аденілатциклази і внеску цАМФ-залежних внутрішньоклітинних процесів у синаптичне збудження й гальмування гладеньких м'язів шлунково-кишкового тракту.

Експерименти показали, що активація аденілатциклази форсколіном виявила складний і неоднозначний характер дії на синаптичну передачу збудження й гальмування гладеньких м'язів шлунково-кишкового тракту. Так, аплікація форсколіну (0,1 – 10,0 мкМоль/л) викликала гіперполяризацію мембрани ГМК і пригнічення спонтанної активності. Цей ефект форсколіну не залежав від наявності або відсутності неспецифічного блокатора мускаринових рецепторів - атропіну в позаклітинному середовищі. В атропінізованих м'язових смужках під впливом форсколіну ГСП не зазнавали істотних змін, незважаючи на зниження рівня мембранного потенціалу ГМК. В експериментах на неатропінізованих препаратах ефективність гальмуючої синаптичної передачі при дії форсколіну була більш вираженою. За цих умов, у міру дії форсколіну, ГСП зазнавали істотних змін: амплітуда і час наростання ГСП поступово зменшувалися й у переважній більшості випадків з'являлися ЗСП. ЗСП, що виникали на фоні дії форскаліну, були складної форми і складалися з початкового ЗСП і подальшим виникненням слідової деполяризації або слідової гіперполяризації.

Необхідно зазначити, що виникнення ЗСП при дії форсколіну не можна пояснити тільки зсувом рівня мембранного потенціалу вбік гіперполяризації. Якщо на фоні гіперполяризації в зовнішній розчин Кребса додати атропін, то ЗСП пригнічувалися. Однак амплітуда ГСП не тільки відновлювалася та перевищувала вихідний рівень без зміни мембранного потенціалу гладеньком’язових клітин. Збільшення амплітуди ГСП, у порівнянні з вихідною величиною, при дії атропіну свідчить про маскування процесів збудження з одночасним розвитком гальмуванням гладеньких м'язів (рис. 3).

Рис. 3. | Пригнічення неадренергічних ГСП неатропінізованої м’язової смужки дистального відділу товстого кишечнику під впливом форсколіну (0,1 мкМоль/л).

а – ГСП у контролі; в, г – ЗСП, які виникають на 15 хв дії форскаліну у гладеньком’язових клітинах на поодиноке інтрамуральне подразнення; безперервний запис синаптичних потенціалів на фоні дії форскаліну (б) та після додавання до розчину Кребса з форсколіном 1 мкМоль/л атропіну (д); е – ГСП, що виникає на 5 хв дії атропіну (і на 20 хв дії форсколіну). |

Якщо при інтрамуральному подразненні гладеньком’язові клітини генерували складну відповідь типу ЗСП – ГСП, то під впливом форсколіну ЗСП збільшувалися, а ГСП зменшувалися аж до повного їхнього зникнення. Подальші експерименти показали, що описаний вище пригнічуючий ефект форсколіну на синаптичну передачу гальмування не обумовлений підвищенням внутрішньоклітинної концентрації цАМФ. Нами було досліджено дію мембраннопрониклої форми цАМФ – дибутирил-цАМФ (100 мкМоль/л) – на неадренергічні ГСП неатропінізованих гладеньких м’язів. Експерименти показали, що він суттєво не змінював рівень мембранного потенціалу ГМК й амплітудно-кінетичні параметри ГСП, і тим самим не імітував вищеописану дію форсколіну.

Особливості клітинних механізмів передачі сигналу при одночасній активації холіно- і пуринорецепторів у гладеньких м’язах

Результати приведених вище експериментів показали, що в ГМК шлунково-кишкового тракту збудливі й гальмівні впливи взаємодіють між собою складним і неоднозначним чином. Однак, виявити взаємодію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів у випадку спільної активації холіно- і пуринорецепторів неможливо у зв'язку з тим, що дослідження синаптичних потенціалів в умовах тривалого інтрамурального подразнення ускладнюється пресинаптичними ефектами. Тому ми досліджували дію збудливих і гальмівних нейропередавачів при їхній екзогенній аплікації на м'язові смужки. Тривала аплікація, агоніста мускаринових холінорецепторів, карбахоліну 10 мкМоль/л супроводжувалася стійкою деполяризацією мембрани ГМК і скороченням м'язових смужок. Необхідно зазначити, що, незважаючи на стійкий характер деполяризації мембрани ГМК, початкове фазне скорочення швидко зменшувалося, а тонічний компонент скорочення (що становить приблизно третину початкової скорочувальної реакції) підтримувався на постійному рівні протягом усього часу (10 хв) аплікації карбахоліну. Тривала преінкубація препаратів з блокатором фосфоліпази С U 73122 (10 мкМоль/л) суттєво не впливала ні на рівень деполяризації мембрани ГМК, ні на карбахолін-індуковане скорочення. Отриманий результат свідчать про те, що участь фосфоліпази С у збудливій дії карбахоліну (деполяризації мембрани ГМК і скороченні м'язової смужки) незначна.

Як вже було зазначено раніше, в генерації пуринергічних ГСП і АТФ-викликаній гіперполяризації беруть участь як залежні (приблизно 50%), так і незалежні від фосфоліпази С механізми. Тому важливо було дослідити участь фосфоліпази С у гальмівній дії АТФ в умовах тривалої активації холінорецепторів. Карбахолін (10 мкМоль/л) викликав фазно-тонічне скорочення м'язових смужок (рис. 4, А), а наступне додавання 1 мМоль/л АТФ у розчин Кребса з карбахоліном супроводжувалося розслабленням м'язової смужки до вихідного рівня.

Варто зазначити, що після видалення АТФ із розчину Кребса з карбахоліном завжди спостерігалося транзієнтне скорочення м'язової смужки, що перевищувало по своїй амплітуді тонічний компонент карбахолін-індукованого скорочення постгальмівне скорочення. Преінкубація м'язових смужок у розчині Кребса з блокатором фосфоліпази С U 73122 не призводило до статистично достовірних змін амплітуди й форми карбахолін-індукованого скорочення, а також не впливало на розслаблення м'язових смужок, викликане екзогенною дією АТФ. Таким чином, створюється враження, що в умовах преактивації холінорецепторів розслаблююча дія АТФ опосередковується незалежним від фосфоліпази С шляхом. Оскільки активація фосфоліпази С супроводжується підвищенням внутрішньоклітинного рівня ІР3 у міоцитах, тому важливо було дослідити дію мембранопрониклого антагоніста ІР3-рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) при одночасній активації холіно- і пуринорецепторів. У присутності в розчині Кребса блокаторів фосфоліпази С і ІР3-рецепторів (U 7312 + 2-АРВ) карбахолін-індуковане скорочення змінювалося несуттєво, у той час як за цих умов АТФ-індуковане розслаблення в середньому зменшувалося на 50 %, у порівнянні з контролем, а постгальмівне збудження повністю пригнічувалося. Отже, у вище розглянутому випадку внутрішньоклітинна сигналізація опосередковується шляхами, незалежними від фосфоліпази С.

Рис. 4. | Відсутність пригнічення за дії блокатора інозитолтрифосфатних рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) на викликане АТФ (1 мМоль/л) розслаблення гладеньких м’язів на фоні холінергічного скорочення, зумовленого активацією М3-холінорецепторів.

А – індуковане карбахоліном (КХ, 10 мкМоль/л) скорочення та наступне розслаблення м’язових смужок, викликане дією АТФ, у контролі; Б – теж саме, але після попередньої 30-и хвилинної інактивації М2-холінорецепторів трипітраміном (1мкМоль/л); В – відсутність змін АТФ-викликаного розслаблення м’язової смужки taenia coli після 30-и хвилинної преінкубації препарату в розчині Кребса, до складу якого входили трипітрамін і блокатор ІР3-рецепторів 2-АРВ; штрихова лінія – вихідний рівень м'язового тонусу. |

У зв'язку з тим, що шляхи передачі внутрішньоклітинної сигналізації в умовах активації М2- і М3-холінорецепторів різні, важливо було дослідити взаємодію збудливих і гальмівних впливів на ГМК в умовах активації одного з підтипів мускаринових рецепторів. Виходячи з того, що М3-холінорецептори й Р2У-пуринорецептори сполучені з однаковими G-білками й у випадку дії агоністів, активується фосфоліпаза С при одночасній активації цих рецепторів, внутрішньоклітинні шляхи повинні в тому або іншому ступені взаємодіяти. Експерименти показали, що виключення активації М2-холінорецепторів за допомогою 1мкМоль/л трипітраміну суттєво не позначилося ні на холінергічному скороченні, ні на АТФ-індукованому розслабленні (рис. 4, Б). Таким чином, розслаблююча дія АТФ на фоні М3-викликаного холінергічного скорочення не змінюється. Окрім того, виявилося, що на фоні цього холінергічного скорочення блокування ІР3-рецепторів саркоплазматичного ретикулума ГМК за допомогою 100 мкМоль/л 2-АРВ не змінювало амплітуди АТФ-викликаного розслаблення (рис. 4, В). Усе це говорить про те, що в умовах одночасної активації М3-холінорецепторів і пуринорецепторів процес розслаблення м'язових смужок здійснюється не через активацію ІР3-рецепторів саркоплазматичного ретикулума ГМК, а за допомогою інших внутрішньоклітинних шляхів сигналізації.

За умов інактивації М3-рецепторів селективним блокатором pF-HHSiD не змінюється ні збудлива дія карбахоліну, ні гальмівна дія АТФ на ГМК.


Сторінки: 1 2





Наступні 7 робіт по вашій темі:

Оптимізація антиноцицептивного захисту при операціях з приводу дифузного токсичного зоба в умовах внутрішньовенної анестезії - Автореферат - 31 Стр.
МЕТАБОЛІЧНІ МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ ІММОБІЛІЗАЦІЙНОГО СТРЕСУ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ - Автореферат - 21 Стр.
КОМПЛЕКСНИЙ КОНТРОЛЬ І КОРЕКЦІЯ НАВЧАЛЬНОЇ ДІЯЛЬНОСТІ СТУДЕНТІВ ВИЩИХ ТЕХНІЧНИХ НАВЧАЛЬНИХ ЗАКЛАДІВ У ПРОЦЕСІ ВИВЧЕННЯ ЗАГАЛЬНОЇ ФІЗИКИ - Автореферат - 28 Стр.
ІННОВАЦІЙНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ РОЗВИТКУ СІЛЬСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА - Автореферат - 28 Стр.
ОБГРУНТУВАННЯ ЕЛЕМЕНТІВ ТЕХНОЛОГІЇ ВИРОЩУВАННЯ КАПУСТИ САВОЙСЬКОЇ В ЛІСОСТЕПУ УКРАЇНИ - Автореферат - 31 Стр.
ТЕХНОЛОГІЧНІ ТА СТРУКТУРНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ВІЛЬНОГО СПІКАННЯ КЕРАМІКИ НА ОСНОВІ НІТРИДУ АЛЮМІНІЮ - Автореферат - 43 Стр.
ЦЕМЕНТНО-ПІЩАНІ БЕТОНИ ТА ВИРОБИ, ОТРИМУВАНІ НАПІВСУХИМ ПРЕСУВАННЯМ БЕЗ ТЕПЛОВОЛОГОВОЇ ОБРОБКИ - Автореферат - 24 Стр.